《ایجاد روش تشخیص Rhabdovirus Micropterus Salmoides بر اساس سیستم CRISPR CAS13A Express
Zhang Minlin ، Huang Fengqi ، Zuo Xiaoling ، Liang Jiantao ، Liang Kaishan ، Dan Jinhong ، Li Zongyang ، Yu Jie ، Luo Liyuan ، Xie Zijie ، Zhao Huihong ، Wang qing ایجاد یک روش بزرگ بر روی Casspry/Casprins Prose Louse Basvivirus بر اساس Crisprate Baskivivius Basvivirus Baskivivius Baskivivius Baskivivius Basklous مجله چینی هیدروبیولوژی ، 2024 ، 48 (2): {4}}. doi: 10.7541/2023.2023.0199
Micropterus Salmoides ، همچنین به عنوان باس کالیفرنیا یا باس سیاه آمریکایی شناخته می شود ، یک ماهی آب شیرین بومی آمریکای شمالی است. در سالهای اخیر ، به دلیل تقاضای بالای بازار ، به یک ماهی مهم در سراسر جهان تبدیل شده است: Micropterus Salmoides دارای گوشت محکم ، تعداد کمی از استخوان ها ، طعم خوشمزه ، تغذیه غنی ، به ویژه پروتئین بالا و چربی کم است که تقاضای مصرف کنندگان برای غذای سالم را برآورده می کند. بنابراین ، قیمت بازار نسبتاً زیاد است و اغلب در بازار پذیرایی سطح بالا استفاده می شود. رشد سریع: Micropterus Salmoides به سرعت رشد می کند و به طور کلی می تواند به مشخصات کالایی در ماه {1}} برسد. برای پرورش چرخه کوتاه مناسب است و می تواند به سرعت بازده سرمایه گذاری را تحقق بخشد. مقاومت در برابر بیماری قوی: در مقایسه با سایر ماهی های کشاورزی ، Micropterus Salmoides سازگاری قوی با محیط زیست ، شیوع بیماری در مقیاس بزرگ کمتر دارد و خطرات پرورش را کاهش می دهد. پرورش اکولوژیک: باس بزرگ می توان با سایر ماهی های آب شیرین مانند کپور نقره ای و کپور چمن مخلوط کرد که به دستیابی به تعادل زیست محیطی برکه و به حداکثر رساندن استفاده از منابع ، بهبود بیشتر کارایی پرورش و سایر عوامل کمک می کند. این مورد توسط شام ها و کشاورزان آبزی پروری مورد استقبال قرار می گیرد و مقیاس پرورش آن در سالهای اخیر به سرعت رشد کرده است.
اگرچه Salmoides Micropterus نسبتاً مقاوم در برابر بیماری است ، اما ممکن است در شرایط ضعیف پرورش از برخی بیماری ها رنج بکشند. در میان آنها ، Micropterus Salmoides Rhabdovirus (MSRV) بسیار مضر است: برای اولین بار در سال 1991 در فلوریدا ، ایالات متحده کشف شد. این ویروس در ابتدا در جمعیت باس های وحشی وحشی تشخیص داده شد و سپس به تدریج در بسیاری از دریاچه های آب شیرین و مخازن در ایالات متحده پخش شد و یکی از اصلی ترین آسیب های اصلی باس بزرگ بود.
علائم بالینی ماهی بیمار
پاسخ: باس سالم Largemouth ، فلش نشانگر کیسه زرده است. ب: باس بزرگ Largemouth ، فلش نشانگر کیسه زرده است.
منبع انتقال غالباً سرخ شده یا ماهی های بالغ ، بدن آلوده و ماهی های وحشی که ویروس را حمل می کنند ، آلوده است. این ویروس را می توان از طریق تماس مستقیم ، دفع مدفوع و بدن آب منتقل کرد و به احتمال زیاد تحت شرایط نامناسب آب یا شرایط پرورش با چگالی بالا رخ می دهد. انتشار این ویروس می تواند باعث بی حالی ، سرگردان ، تورم شکم و تحریف بدن در ماهی های نوجوان شود و همچنین زخم های نکروز و خونریزی چند ارگان را القا کند. پس از آلوده شدن ، میزان مرگ و میر بیش از 90 ٪ است.
علائم بالینی Salmoides Micropterus آلوده به مصنوعی
پاسخ: باس سالم Largemouth ؛ B ، C ، D: باس Largemouth آلوده به مصنوعی.
هر ساله بیش از 30 ٪ از سرخ های Micropterus به دلیل MSRV از بین می روند. در حال حاضر ، روش های درمان و تشخیص ویروس هنوز نابالغ است و هیچ داروی خاصی برای درمان آن وجود ندارد. بنابراین ، تشخیص ویروس به موقع قبل از عفونت و انجام اقدامات پیشگیرانه مؤثر ، که می تواند ضررهای موجود در فرآیند پرورش را تا حدی کاهش دهد ، بسیار ضروری است.
علاوه بر این ، انجام تشخیص در محل بدون تجهیزات تشخیص پیچیده با فناوری تشخیص موجود دشوار است. در مواجهه با این چالش ، تیم تحقیقاتی دانشگاه کشاورزی چین جنوبی یک روش تشخیص جدید با ترکیب MIRA با سیستم CRISPR ایجاد کرده است. این روش از ویژگی های قوی ، حساسیت بالا و عملکرد ساده برخوردار است ، که باعث افزایش کارایی تشخیص MSRV می شود و همچنین به تشخیص MSRV در اسرع وقت کمک می کند و اقدامات پیشگیری و کنترل را انجام می دهد.
غربالگری ترکیبی آغازگر میرا
برای تقویت قطعه ژن حاوی توالی هدف ، از دو جفت آغازگرهای مختلف MIRA استفاده شد و محصولات تقویت شده در معرض الکتروفورز ژل آگارز قرار گرفتند. نمودار الکتروفورز در موقعیت 100 جفت باز قرار داشت ، و باند های روشن در هر سه خط ظاهر می شدند و این نشان می دهد که محصولات تقویت غیر خاص وجود دارد. باندهای هدف تقویت شده در 250 جفت باز در خطوط 2 و 3 به ترتیب کمی توسط نرم افزار Image J مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل کمی توسط "مقدار خاکستری" بیان شد. از نتایج تجزیه و تحلیل ، می توان نتیجه گرفت که هرچه مقدار خاکستری پایین تر باشد ، میزان استفاده از آغازگر نیز بیشتر است ، یعنی ، راندمان تقویت اتصال خاص آغازگر بالاتر می رود.
نتایج نشان داد که هنگام استفاده از جفت آغازگر MIRA-F2/R2 ، بازده تقویت کننده اتصال خاص زیاد بود.
غربالگری جفت پرایمر میرا تصویر ژل الکتروفورز و تجزیه و تحلیل مقدار خاکستری
الف خط الکتروفورز M: 2000 BP DNA نشانگر ؛ خط الکتروفورز 1. تقویت نمونه DNA منفی ؛ خط الکتروفورز 2. MIRA-F1/R1 Primer Pair قطعه هدف را تقویت می کند (224 جفت باز همانطور که در جعبه نشان داده شده است) ؛ خط الکتروفورز 3. جفت پرایمر Mira-F2/R2 قطعه هدف را تقویت می کند (255 جفت باز همانطور که در جعبه نشان داده شده است). ب. تجزیه و تحلیل مقدار خاکستری باند (همانطور که در جعبه نشان داده شده است)
سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A
پس از اتمام واکنش سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A ، برای مشاهده نتایج با نور ماوراء بنفش تابش می شود.
نمودار روشنایی سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-FLUORENCES
{{0}. کل سیستم با استاندارد RNA اضافه شده است. 4. هیچ crrna اضافه نشده است. 5. هیچ پروتئین CAS13A اضافه نشده است. 6. هیچ گزارشگر گزارشگر SSRNA اضافه شده است. 7. کنترل منفی
سیستم واکنش بهینه CRISPR/CAS13A-MSRV
ما آزمایشات را با استفاده از استانداردهای RNA و RNA نمونه تقویت شده انجام دادیم. سرعت موقعیت یابی RNA هدف با CRRNA2 بهتر از CRRNA1 بود. CRRNA1 سیگنال فلورسانس نهایی قوی تر از CRRNA2 داشت. استفاده مخلوط از crrna {4}} crRNA2 در نسبت های مساوی می تواند مزایای هر دو را ترکیب کند و به راندمان واکنش بهتر دست یابد.
بهینه سازی شرایط واکنش تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV و نتایج تشخیص
الف مقایسه نتایج تشخیص RNA استاندارد با استفاده از CRRNA با توالی های فضا مختلف.
ب. مقایسه داده های سیگنال فلورسانس RNA استاندارد شناسایی شده توسط سیستم تشخیص در دماهای مختلف.
ج. مقایسه داده های سیگنال فلورسانس از RNA استاندارد شناسایی شده با استفاده از پروب های گزارشگر RNA با غلظت های مختلف.
د. مقایسه نتایج تشخیص RNA استاندارد با استفاده از مجتمع های پروب CAS13A/CRRNA با نسبت غلظت های مختلف.
برای کشف تأثیر دمای واکنش بر سیستم تشخیص ، دمای واکنش متفاوت 31 درجه ، 34 درجه ، 37 درجه و 41 درجه تعیین شد. دمای واکنش بهینه سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV 37 درجه بود.
برای کشف تأثیر غلظت پروب گزارشگر SSRNA در سیستم تشخیص ، در محدوده آزمایش ، شدت فلورسانس با غلظت پروب گزارشگر SSRNA ارتباط مثبت داشت. اثر تشخیص غلظت پروب گزارشگر ssRNA در 500-700 nmol/l تفاوت چندانی نداشت. با توجه به مشکلات اقتصادی واقعی ، غلظت بهینه گزارشگر SSRNA گزارشگر 500 نانومول در لیتر بود.
برای کشف تأثیر نسبت غلظت واکنش CAS13A و CRRNA مختلف بر سیستم تشخیص ، هنگامی که نسبت CAS13A: CRRNA 4: 1 و 3: 1 بر اساس نسبت 100 نانومول در لیتر در هر بخش ، CAS13A به اشباع رسید. هنگامی که مقدار CAS13A ثابت بود ، شدت سیگنال فلورسانس با افزایش میزان CRRNA ارتباط مثبت نداشت. بنابراین ، هنگامی که نسبت CAS13A به CRRNA 2: 1 است ، سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV می تواند حداکثر فعالیت تشخیص را بدست آورد.
ارزیابی حساسیت
به منظور کشف حداقل غلظت تشخیص MSRV توسط سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV ، استاندارد RNA 10 بار در یک سری رقیق شد و توسط سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV تشخیص داده شد. سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV می تواند حداقل 100fm RNA هدف MSRV را تشخیص دهد. هنگامی که غلظت RNA هدف پایین تر از 100fm است ، سیگنال فلورسانس تشخیص داده شده توسط دستگاه تفاوت معنی داری با کنترل خالی ندارد. بنابراین ، سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV می تواند حداقل 100fm از MSRV SSRNA را تشخیص دهد.
ارزیابی ویژگی سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV برای MSRV
تست نمونه
برای نمونه های ماهی بیمار با علائم آشکار بیماری که از مزارع باس دریایی جمع آوری شده است ، ما تأیید کردیم که آیا بیماری زایی آلوده به ماهی بیمار MSRV است. ما از آغازگرهای خاص برای توالی پروتئین کپسید MSRV برای تقویت PCR استفاده کردیم و باندهای مربوطه را در نمودار الکتروفورز برای آزمایش ارسال کردیم. پس از مقایسه ، ما تأیید کردیم که این MSRV است.
تأیید اطلاعات توالی MSRV
الف تقویت PCR از باند محصول 228 جفت باز از آغازگرهای MSRV ؛ ب. توالی پروتئین کپسید MSRV در مقایسه با NCBI ، توالی های BOLD سایت های اتصال پرایمر بالادست و پایین دست هستند و مناطق سایه دار مکان های هدف برای اتصال CRISPR/CAS13A-MSRV CRRNA1 هستند
نمونه های ماهی بیمار آلوده به MSRV تحت درمان قرار گرفتند و برای RNA ویروسی پیش ساخته شدند و سپس با گروه کنترل منفی آزمایش شدند. در همان زمان ، cDNA نمونه ها برای مقایسه با qPCR معمولی استخراج شد. نمونه های مثبت (شماره 3 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 12 ، 13 ، 14 و 15) شناسایی شده توسط سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV همان نتایج qPCR معمولی بود ، جایی که مقدار CQ qPCR بین 18 تا 25 بود. در حالی که تعداد چرخه آستانه نمونه های منفی (شماره 1 ، 2 ، 4 ، 5 ، 9 ، 10 و 11) بیشتر از 38 بود ، نشان می دهد که نمونه ها ویروس MSVR را حمل نمی کنند. به طور خلاصه ، داده های تشخیص سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV و RT-qPCR معمولی سازگار بودند ، نشان می دهد که سیستم تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV امکان پذیر است و می تواند جایگزین روشهای تشخیص اصلی و پیچیده اصلی در یک نوع خاص باشد.
نمودار مقایسه عمودی داده های تشخیص qPCR نمونه با qPCR و CRISPR
الف تشخیص qPCR از نمودار شماره آستانه نمونه بالینی MSRV. تعداد چرخه نمونه شناسایی شده با شماره چرخه مرجع منفی با استفاده از آنالیز آزمون t مقایسه شد (** P<0.01);
ب. CAS13A همراه با تشخیص MIRA از نمودار فلورسانس نمونه بالینی MSRV. مقدار فلورسانس نمونه شناسایی شده با مقدار فلورسانس مرجع منفی با استفاده از آنالیز آزمون t مقایسه شد (** P<0.01)
به طور خلاصه ، روش تشخیص CRISPR/CAS13A-MSRV که در این مطالعه ایجاد شده است ، نیازی به ابزارهای تجربی گران قیمت ندارد و تشخیص سریع ، دقیق و راحت را در محل انجام می دهد. بنابراین ، اگر این روش تشخیص برای کشف به موقع MSRV در فرآیند پرورش واقعی و انجام اقدامات هدفمند و مؤثر استفاده شود ، می تواند ضررهای ناشی از بیماری های موجود در فرآیند پرورش را تا حد زیادی کاهش دهد. علاوه بر این ، این روش تشخیص سریع ، بسیار حساس و خاص است و از کاربرد و پیشرفت بسیار خوبی برخوردار است.