میگو چمن یک گونه مهم اقتصادی در صنعت آبزی پروری آب شیرین چین است. با این حال ، در سالهای اخیر ،میکروسپوریدیوم کبدی(EHP) ، انگل آلوده به سلولهای کبدی میگو ، به شدت بر صنعت تأثیر گذاشته است. از آنجا که در حال حاضر هیچ داروی یا واکسن موثری برای درمان این بیماری وجود ندارد ، تشخیص سریع و دقیق برای جلوگیری از شیوع آن بسیار مهم است.
a.magnified 9. 0 × 1 {4}} 3 بار ؛ ب. 104 بار 5.0 × 5.0 بزرگنمایی.
Qiao Yi ، Shen Hui ، Wan Xihe ، Fan Xianping ، Jiang GE ، Li Hui ، Wang Libao ، Shi Wenjun ، Cheng Jie. انزوا و مشاهده مورفولوژیکی میکروسپوریدیوم کبدی در Litopenaeus vannamei. مجله علوم شیلات چین ، 2018 ، 25 (5): {3 {}. doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
تشخیص EHP در درجه اول به روشهای زیست شناسی مولکولی متکی است ، که فناوری PCR رایج ترین است. با این حال ، در حالی که PCR حساسیت بالایی را ارائه می دهد ، به تجهیزات گران قیمت PCR و یک محیط آزمایشگاهی تخصصی نیاز دارد و آن را برای استفاده در زمینه نامناسب می کند. برای پرداختن به این موضوع ، تیم تحقیق دو روش تشخیص سریع را بر اساس فناوری MIRA ایجاد کرد. این روشها حساسیت بالا ، پاسخ سریع و عملکرد آسان را ارائه می دهند ، امکان تشخیص کارآمد و سریع EHP در میگو در محل را بدون نیاز به تجهیزات آزمایشگاهی پیچیده فراهم می کند ، بنابراین شکاف را در روش های تشخیص فعلی پر می کند.
معرفهای تقویت کننده مورد استفاده در مطالعه:
- کیت تقویت سریع ایزوترمال DNA (اساسی)
- کیت تقویت سریع ایزوترمال DNA (نوع نوار طلای کلوئیدی)
فناوری MIRA یک روش تقویت اسید نوکلئیک سریع ایزوترمال چند آنزیمی است. اصل اصلی آن شامل عملکرد هماهنگ پروتئین های عملکردی متعدد در دمای محیط برای دستیابی به تقویت سریع اسید نوکلئیک است و باعث می شود تشخیص اسید نوکلئیک در سایت واقعاً قابل حمل باشد.
روشهای تحقیق
استخراج نمونه
تیم تحقیقاتی نمونه های میگو آلوده و سالم را از سه مزارع میگو در استان لیائونینگ جمع آوری کردند و DNA را از سلولهای کبدی میگو استخراج کردند.
طرح اولیه
سه مجموعه از آغازگرهای MIRA با هدف قرار دادن ژن پروتئین سرین S8 EHP (شماره الحاق GenBank: در سال 182063) طراحی شد. این ژن دارای سایت های فعال منحصر به فردی است و از ویژگی تشخیص آن اطمینان می دهد.
تشخیص Mira-Age و Mira-LFD
(الف) دمای واکنش بهینه در سن. M: DL 500 Marker ؛ N: کنترل منفی ؛ سویه 1-5: 25 درجه ، 30 درجه ، 37 درجه ، 39 درجه و 42 درجه.
(ب) زمان واکنش بهینه در سن. M: DL 500 Marker ؛ N: کنترل منفی ؛ 1: 10 دقیقه ؛ 2: 20 دقیقه ؛ 3: 30 دقیقه ؛ 4: 40 دقیقه.
(ج) دمای واکنش بهینه-LFD بهینه شده. N: کنترل منفی ؛ 1: 25 درجه ؛ 2: 30 درجه ؛ 3: 37 درجه ؛ 4: 39 درجه ؛ 5: 42 درجه.
(د) زمان واکنش بهینه-LFD. N: کنترل منفی ؛ 1: 5 دقیقه ؛ 2: 10 دقیقه ؛ 3: 20 دقیقه.
دو روش تشخیص MIRA ، MiRAAGE (الکتروفورز ژل آگارز) و MIRA-LFD (ایمونواسی جریان جانبی طلای کلوئیدی) برای تشخیص EHP استفاده شد. تیم تحقیق از طریق آزمایش ، دمای واکنش و زمان را بهینه کرد. Mira Age DNA هدف را در 30 دقیقه با 37 درجه تقویت کرد ، در حالی که MIRA-LFD در تنها 10 دقیقه با 37 درجه تقویت را انجام داد و نتایج در طی 5 دقیقه قابل خواندن بود.
نتایج تجربی
ویژگی و حساسیت
(الف) ویژگی تشخیص سن. M: DL 1000 Marker ؛ پ: Nosema Bombycis ؛ 1: EHP ؛ 2: آنسفالیتوزون ؛ 3: میکروسپوریدیا ؛ 4: ویروس سندرم نقطه سفید ؛ 6: غیر طبیعی ؛ N: کنترل منفی.
(ب) ویژگی تشخیص RPA-LFD. پ: Nosema Bombycis ؛ N: کنترل منفی ؛ 1: EHP ؛ 2: آنسفالیتوزون ؛ 3: میکروسپوریدیا ؛ 4: ویروس سندرم نقطه سفید ؛ 6: غیر طبیعی.
(ج) حساسیت AGE-AGE با رقیق شیب پلاسمیدهای نوترکیب. M: DL 500 Marker ؛ N: کنترل منفی ؛ 1: 4.7 × 10^5 نسخه/میکرولیتر ؛ 2: 4.7 × 10^4 نسخه/میکرولیتر ؛ 3: 4.7 × 10^3 نسخه/میکرولیتر ؛ 4: 4.7 × 10^2 نسخه/میکرولیتر ؛ 5: 4.7 نسخه/میکرولیتر ؛ 6: 4.7 نسخه/میکرولیتر.
(د) حساسیت رمان LFD با رقیق شیب پلاسمیدهای نوترکیب. N: کنترل منفی ؛ 1: 4.7 × 10^5 نسخه/میکرولیتر ؛ 2: 4.7 × 10^4 نسخه/میکرولیتر ؛ 3: 4.7 × 10^3 نسخه/میکرولیتر ؛ 4: 4.7 × 10^2 نسخه/میکرولیتر ؛ 5: 4.7 نسخه/میکرولیتر ؛ و 6: 4.7 نسخه/میکرولیتر.
این آزمایشات نشان داد که فناوری MIRA از ویژگی های بالایی برخوردار است و EHP را بدون واکنش به سایر عوامل بیماری زا تشخیص می دهد. از نظر حساسیت ، هر دو روش محدودیت تشخیص 4.7 نسخه در میکرولیتر ، به طور قابل توجهی بالاتر از حساسیت PCR سنتی بودند.
آزمایش نمونه بالینی
نتایج حاصل از آزمایش 30 نمونه بالینی نشان داد که MiRAAGE و MIRA-LFD میزان مثبت 70 ٪ ، کمی پایین تر از 80 ٪ qPCR اما به طور قابل توجهی بالاتر از 56.7 ٪ PCR سنتی است.
چشم اندازهای کاربردی
روشهای تشخیص مبتنی بر MIRA باعث تقویت سریع ژن های هدف در دماهای ثابت می شود. به طور خاص ، روش MIRA-LFD می تواند فقط در 10 دقیقه بدون نیاز به تجهیزات آزمایشگاهی پیچیده ، نتیجه بگیرد و آن را برای استفاده در محل در مزارع میگو ایده آل کند. حساسیت و ویژگی بالای این فناوری ، آن را به ابزاری کارآمد برای تشخیص زودرس و کنترل EHP تبدیل می کند و از این طریق از سلامت و توسعه صنعت کشاورزی میگو چمن محافظت می کند.
در میان این روش ها ، ایمونواسی جریان جانبی طلای کلوئیدی (MIRA-LFD) به دلیل سادگی و نتایج شهودی آن به ویژه برای برنامه های موجود در سایت مناسب است. کشاورزان میگو چمن می توانند به سرعت عفونت های EHP را تشخیص داده و پاسخ دهند ، قابلیت های کنترل بیماری را بهبود بخشند ، به طور قابل توجهی راندمان کشاورزی را افزایش داده و باعث کاهش خسارات اقتصادی شوند.