تشخیص مرئی و سریع چپماپاروویروس گربه با استفاده از تکثیر سریع ایزوترمال چند آنزیمی و روش قطری جریان جانبی
مجله:مرزها در میکروبیولوژی سلولی و عفونت
ضریب تاثیر:4.6
چپماپاروویروس گربه(FeChPV)یک پاروویروس جدید است که برای اولین بار در گربه های اسهالی در کانادا در سال 2019 شناسایی شد. بیماری زایی و ویژگی های مولکولی آن نامشخص است و تنوع میزبان و ژنتیکی را نشان می دهد که به بررسی اپیدمیولوژیک بیشتری نیاز دارد. در حال حاضر، هیچ روش استانداردی برای تشخیص FeChPV وجود ندارد.
روش تکثیر سریع همدما چند آنزیمی-روش قطری جریان جانبی (MIRA-LFD)به طور موفقیت آمیزی برای شناسایی ویروس های مختلف استفاده شده است و مزایایی مانند سرعت، سادگی و عدم نیاز به ابزار دقیق را ارائه می دهد. تیم تحقیقاتی یک روش MIRA{1}}LFD مناسب برای FeChPV برای رسیدگی به چالشها در تشخیص بالینی مردمی ایجاد کرد. بدون تکیه بر ابزار دقیق،روش MIRA{0}}LFD شناسایی FeChPV را در دمای 37 درجه در عرض 20 دقیقه تکمیل کرد و هیچ واکنش متقابل-با سایر ویروس ها نشان نداد. حد تشخیص 32.3 کپی در میکرولیتر بود،10 برابر بیشتر از روش PCR. علاوه بر این، روش MIRA{2}}LFD 29 نمونه FeChPV- مثبت را در بین 417 گربه اسهالی با نرخ مثبت کمی بالاتر از روش PCR تودرتو شناسایی کرد. این نتایج نشان میدهد که روش MIRA{7}}LFD برای تشخیص FeChPV یک روش کارآمد، اقتصادی، قابل اعتماد و ساده است که به پیشگیری و کنترل زودهنگام عفونت FeChPV کمک میکند.
1-روشهای تجربی
نمونه های بالینی:نمونههای سواب رکتوم مورد استفاده در این مطالعه از 632 گربه (شامل 417 گربه مبتلا به اسهال و 115 گربه سالم) و 474 سگ (شامل 342 سگ مبتلا به اسهال و 132 سگ سالم) در کلینیکهای دامپزشکی در استان گوانگدونگ، منطقه مونگول، هنان، هنان، جمعآوری شد. بین 2022 و 2024
تقویت اسید نوکلئیک:اسید نوکلئیک DNA استخراج شده به سیستم MIRA اضافه شد. Recombinase و آغازگرها یک مجتمع تشکیل دادند. آنها با کمک پروتئین های کمکی و پروتئین های تک رشته ای-به الگوی DNA دو رشته ای-تهاجم کردند. آغازگرها به نواحی مکمل همولوگ متصل می شوند تا یک ناحیه حلقه D را تشکیل دهند، در حالی که recombinase از مجموعه جدا می شود. پلیمراز به انتهای 3' پرایمرها متصل شد و سنتز DNA را آغاز کرد و به طور نمایی ناحیه هدف را روی الگو تقویت کرد. این فرآیند به سرعت و کارآمد انجام شد و در نتیجه تنها در 15 دقیقه به تقویت فوق العاده سریع- قطعه هدف رسید.
توسعه رنگ نوار تست:محصول تقویت اسید نوکلئیک 1:10 رقیق شد، روی نوار تست اعمال شد و نتایج پس از 5 دقیقه خوانده شد.
کل فرآیند از تقویت اسید نوکلئیک تا توسعه رنگ نوار تست تنها 20 دقیقه طول کشید.
محصولات بیولوژیکی آینده آمپر{0}}در آزمایش استفاده شد:
در این مطالعه، چهار مجموعه طراحی شده از ترکیبات{0}پرایمر خاص غربالگری شدند. هر دو نوار تست الکتروفورز ژل آگارز و اسید نوکلئیک برای ارائه نتیجه استفاده شدند. هر چهار ترکیب{3}}پرایمر میتوانند ویروس FeChPV را شناسایی کنند. با توجه به نتایج الکتروفورز ژل آگارز، ترکیب FeChPV-4 روشنترین باند هدف را نشان داد، بنابراین این ترکیب برای آزمایشهای بعدی انتخاب شد.
با توجه به نتایج الکتروفورز ژل آگارز، تقویت به مدت 5، 10، 15 و 20 دقیقه همگی نوار هدف را ایجاد کردند. شدت باند هدف در 15 دقیقه تقویت به اوج خود رسید و 15 دقیقه به عنوان زمان واکنش بهینه برای این روش تعیین شد. تقویت در 36 درجه، 37 درجه، 38 درجه، 39 درجه و 40 درجه همگی باند هدف را تولید کردند که روشن ترین باند در 39 درجه مشاهده شد و دمای 39 درجه را به عنوان دمای واکنش بهینه برای این سنجش تعیین کرد.
(شکل A: 1: تقویت 5 دقیقه؛ 2: تقویت 10 دقیقه؛ 3: تقویت 15 دقیقه؛ 4: تقویت 20 دقیقه) (شکل B: 1: تقویت 36 درجه؛ 2: تقویت 37 درجه؛ 3: تقویت 38 درجه؛ 4: تقویت 38 درجه؛ 4: تقویت: 5 درجه؛ 4: تقویت: 5 درجه)
2. عملکرد تشخیص
حساسیت:
(شکل A: نتایج MIRA ارائه شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز)
(شکل B: نتایج PCR تودرتو با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز ارائه شده است)
(شکل C: نتایج MIRA ارائه شده با استفاده از نوارهای آزمایش اسید نوکلئیک)
نمونه ها تحت رقت های سریالی 10 برابری قرار گرفتند که از 3.23×106 کپی / میکرولیتر شروع شد. PCR تودرتو با الکتروفورز ژل آگارز می تواند به طور پایدار 3.23×102 کپی در میکرولیتر را تشخیص دهد. MIRA با الکتروفورز ژل آگارز و MIRA با نوارهای آزمایش اسید نوکلئیک هر دو میتوانند به طور پایدار 3.23×101 کپی در میکرولیتر را تشخیص دهند.
روش MIRA با استفاده از دو فرمت ارائه نتایج متفاوت حساسیت ثابتی را نشان داد و حساسیت روش MIRA نسبت به PCR تودرتو برتر بود.
خاص بودن:
(1: FeChPV، چپماپاروویروس گربه؛ 2: FPV، ویروس پانلوکوپنی گربه؛ 3: FeAstV، آستروویروس گربه؛ 4: FBoV، بوکاویروس گربه؛ 5: CachaV، چاپاروویروس سگ؛ 6: کنترل منفی)
روش جدید MIRA-LFD فقط FeChPV را شناسایی کرد و هیچ واکنش متقابل-با سایر ویروس های مرجع نشان نداد، که نشان دهنده ویژگی خوب است.
3. خلاصه مطالعه
این مطالعه یک روش MIRA{0}}LFD برای تشخیص FeChPV بدون نیاز به ابزارهای دقیق- ایجاد کرد. به عنوان یک روش تشخیص کارآمد، مقرون به صرفه و قابل اعتماد با حساسیت و ویژگی بالا، روش MIRA{3}}LFD برای تشخیص بالینی مناسبتر است و پشتیبانی فنی برای پیشگیری و کنترل اولیه عفونت FeChPV ارائه میکند.
4.AMP-بیوتکنولوژی آینده
تقویت اسید نوکلئیک سریع همدما با چند آنزیم MIRA یک فناوری است که واقعاً تشخیص سریع- سایت را امکان پذیر می کند.
فناوری MIRA مبتنی بر مکانیسم ترمیم نوترکیبی ژن in vivo است، با تکیه بر عملکرد هم افزایی چندین پروتئین عملکردی در دمای اتاق برای دستیابی به تکثیر اسید نوکلئیک سریع (5{5}}20 دقیقه)، حساس، خاص و ایمن در دمای اتاق (25-45 درجه). به دلیل ماهیت همدما بودن فناوری MIRA، نیاز به تجهیزات کم و عملکرد ساده دارد. از طریق دستگاههای کوچک قابل حمل، میتوان آن را در آزمایشهای خط مقدم در سناریوهای کاربردی مختلف به کار برد، آزمایش اسید نوکلئیک سریع و دقیق را به تنظیماتی مانند POCT، آزمایش خانگی، مزارع کشاورزی و{7}}اجرای قانون در سایت رساند. بر اساس فناوری MIRA، Amp-بیوتک آینده مجموعهای از محصولات آزمایش سریع در سایت را توسعه داده است، از جمله عوامل انتشار سریع اسید نوکلئیک، معرفهای تقویت اسید نوکلئیک سریع همدما، نوارهای آزمایش طلای کلوئیدی، و تجهیزات قابل حمل کوچک شده، و یک راهحل کلی برای آزمایش مولکولی {1} را ایجاد کرده است. علاوه بر این، فناوری MIRA Amp-future مزایای کاربردی را در صورت ترکیب با فناوری CRISPR، NGS، SNP، microfluidics و موارد دیگر ارائه می دهد.
علاوه بر مجموعهای از محصولات تست سریع در سایت که در بالا نشان داده شده است، Amp-بیوتک آینده نیز ارائه میدهد:
معرف های تحقیقاتی:ارائه مواد خام معرف و پشتیبانی فنی برای تحقیقات علمی پایه و همچنین منابع منابع پروژه.
تولید OEM:قادر به تولید مستقل-خلوص-محصولات نهایی{1}}بالا-در کل فرآیند، دستیابی به تولید در مقیاس صنعتی-.
توسعه پروژه به سفارش:اطلاعات توالی و نتایج تجزیه و تحلیل تراز توالی، طراحی و سنتز پرایمر{0} پروژه، سنتز و نمونه های پلاسمید پروژه، گزارش ها و نتایج پروژه و غیره.
برای اطلاعات بیشتر، به پرس و جو خوش آمدید.